細胞凍存與復(fù)蘇是一種用于長期儲存細胞的技術(shù),。在這個過程中,，細胞被置于低溫環(huán)境中,，減緩其代謝活動。通過將細胞冷凍保存在液氮中（通常為-196℃）,，細胞暫時脫離生長狀態(tài),，但其細胞特性得以保存。當需要時,，可以通過復(fù)蘇將這些凍存的細胞重新激活,，以供實驗使用。這種方法能夠適度地保存一定數(shù)量的細胞,，防止細胞受到污染或其他意外事件的影響,，從而發(fā)揮了細胞保種的作用。
本文將為大家介紹細胞凍存與復(fù)蘇的技術(shù)要點和操作步驟,。
細胞凍存原理
當細胞降溫至零度以下,，可以產(chǎn)生以下變化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質(zhì)濃度升高,，并在細胞內(nèi)形成冰晶,。
如果緩慢冷凍,，可使細胞逐步脫水，以防止細胞內(nèi)形成大冰晶,；相反,，結(jié)晶就大，大結(jié)晶會造成細胞膜,、細胞器的損傷和破裂,。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶,，即冰晶的重結(jié)晶,。
低溫保護劑的應(yīng)用原理
1、在細胞凍存時加入低溫保護劑,，增加細胞滲透壓穩(wěn)定性,，減緩慢速降溫過程中的脫水皺縮現(xiàn)象，能大大提高凍存效率,；
2,、常用的低溫保護劑是DMSO（二甲基亞砜），它是一種滲透性保護劑,，可迅速透入細胞,，提高胞膜對水的通透性，降低冰點,，延緩凍結(jié)過程能使細胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細胞外,，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶,，從而減少冰晶對細胞的損傷,。
細胞凍存方法
方法一：使用程序凍存盒
步驟1：配制程序凍存液，放在室溫備用或放在4℃預(yù)冷
步驟2：離心收集對數(shù)生長期的細胞（貼壁細胞消化下來離心,，懸浮細胞直接離心,，轉(zhuǎn)速1200rpm或250g，時間3min）
步驟3：用配制好的凍存液重懸細胞,，按照1~1.5mL/管分裝到凍存管中,，擰緊管蓋，做好標記
步驟4：凍存管放入凍存盒,，凍存盒放入-80℃冰箱過夜（24h）
步驟5：凍存管從凍存盒取出,，轉(zhuǎn)移至液氮長期保存
▲ 使用凍存盒操作示意圖
方法二：使用無血清非程序凍存液
步驟1：從冰箱拿出無血清非程序凍存液，待用
步驟2：離心收集對數(shù)生長期的細胞（貼壁細胞消化下來離心,，懸浮細胞直接離心,，轉(zhuǎn)速1200rpm或250g，時間3min）
步驟3：棄上清，加入適量無血清非程序凍存液,，重懸細胞
步驟4：按照1~1.5mL/管的量分裝到凍存管中,，擰緊管蓋，做好標記
步驟5：將凍存管直接移入-80℃冰箱中,，24h后轉(zhuǎn)移至液氮長期保存
▲ 使用無血清非程序凍存液操作示意圖
方法三：手動梯度降溫
步驟1：配制程序凍存液,，放在室溫備用或放在4℃預(yù)冷
步驟2：離心收集對數(shù)生長期的細胞（貼壁細胞消化下來離心，懸浮細胞直接離心,，轉(zhuǎn)速1200rpm或250g,，時間3min）
步驟3：用配制好的凍存液重懸細胞，按照1~1.5mL/管分裝到凍存管中,，擰緊管蓋,，做好標記
步驟4：凍存管按照【4℃（20min）→-20℃（30min）→-80℃（24h）→液氮】的順序放置
▲ 手動梯度降溫操作示意圖
細胞復(fù)蘇原理
復(fù)蘇時，一般以很快的速度升溫,，1-2分鐘內(nèi)即恢復(fù)到常溫,，細胞內(nèi)外不會重新形成較大的冰晶，也不會暴露在高濃度的電解質(zhì)溶液中過長的時間,，從而無冰晶損傷和溶質(zhì)損傷產(chǎn)生,，凍存的細胞經(jīng)復(fù)蘇后仍保持其正常的結(jié)構(gòu)和功能。冷凍保護劑對細胞的冷凍保護效果還與冷凍速率,、冷凍溫度和復(fù)溫速率有關(guān)。
細胞一般采用快速融化以避免慢速融化水分滲入細胞內(nèi)再次形成胞內(nèi)結(jié)晶損傷細胞,。
細胞復(fù)蘇方法
步驟1： 取出凍存管,，從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中,，并不時搖動,，促使其盡快融化。
步驟2：處理細胞懸液,，從37℃水浴中取出凍存管,，打開蓋子，用吸管吸出細胞懸液,，將其加入離心管中,，并滴加10倍以上的培養(yǎng)液，然后混勻,。
步驟3：離心,，進行1,000 rpm，5分鐘的離心,。
步驟4：調(diào)整細胞密度,，棄去上清液，加入含10%小牛血清的培養(yǎng)液以重懸細胞,。進行計數(shù),，調(diào)整細胞密度后,，將其接種到培養(yǎng)瓶中，并置于37℃培養(yǎng)箱中,，靜置培養(yǎng),。
步驟5：繼續(xù)培養(yǎng),，次日更換一次培養(yǎng)液,，繼續(xù)進行培養(yǎng),。
細胞凍存,、復(fù)蘇注意事項
1. 確保細胞狀態(tài)良好：在凍存之前,，確保細胞具有良好的形態(tài),，并且沒有污染,。
2. 選擇適合的凍存液：根據(jù)細胞類型選擇合適的凍存液,，并按照相應(yīng)的操作規(guī)程進行細胞的凍存,。
3. 控制細胞密度：要控制好細胞的密度,，避免過低或過高影響凍存效果。不同的凍存液針對不同細胞有適當?shù)膬龃婷芏确秶?，以確保細胞在冷凍和復(fù)蘇過程中的存活率。
4.盡快冷凍：細胞懸液加入凍存液后盡量短時間在常溫放置,，因為常溫下DMSO對細胞會造成損傷。建議盡快通過程序降溫或一步法等方式進行細胞的冷凍保存,。
5. 合理存放：細胞長期存放在-80℃冰箱時,，建議靠冰箱內(nèi)側(cè)放置樣本，避免開關(guān)冰箱導(dǎo)致溫度不穩(wěn)定影響細胞保存效果,。
6. 檢測存活率：細胞凍存后應(yīng)取出一管進行復(fù)蘇，并檢測細胞的存活率,。為穩(wěn)妥起見，可在細胞凍存半年后進行復(fù)蘇培養(yǎng),，并觀察細胞生長情況后繼續(xù)凍存,。
7. 溫和解凍：使用適當?shù)姆椒ń鈨黾毎?，如將凍存管放?7°C的水浴中直至完全解凍,。避免使用高溫或暴露時間過長的方法,，以減少DMSO對細胞的毒性作用,。
8. 勻速搖晃：細胞融解過程應(yīng)勻速,、均一地搖晃以加速融解,，同時避免流體剪切力對細胞的損傷。
9.盡快去除DMSO：已融解的凍存細胞應(yīng)盡快在常溫下存放,，并盡快離心去除DMSO。
